ug克隆装配怎么用
dna连接反应的影响因素有哪些？
dna连接反应的影响因素有哪些？
在进行DNA分子重组操作中，往往有许多因素会影响到DNA片段的连接，包括连接反应的温度、ATP浓度、连接酶浓度、反应时间、不同DNA片段末端的相对浓度和离子浓度等。
1. 反应温度
温度是影响DNA连接效率的主要因素。连接酶的最佳反应温度是37℃，但是在这个温度下，粘性末端之间退火形成的氢键结合是不稳定的。因此，连接粘性末端的最适温度一般认为4~16℃比较合适。
平末端连接反应受温度的影响较小，连接反应的最适温度为10~20℃，一般可在室温下进行，但温度过高（30℃）也会导致T4 DNA连接酶的不稳定。
2. 连接酶浓度
37℃，20 min内可使l nmol/L 32P在有机焦磷酸与ATP之间产生交换的酶量为1个活性单位。在平末端DNA分子的连接反应中，最适的反应酶量大约是1~2个单位；同样条件下，粘性末端DNA片段间的连接所用酶浓度为0.1个单位时，便可获到较高的连接效率。
3. ATP浓度
ATP浓度对酶的影响很大，其反应终浓度变化范围应在10 μmol/L～1 mmol/L，一般情况下ATP最适终浓度为0.5 mmol/L。ATP浓度上升至5.0 mmol/L时，将影响对平末端的连接；ATP为7.5 mmol/L时，对粘性末端及平末端的连接均会产生抑制作用。
4. DNA片段末端
在反应体系中，由于DNA末端之间的相互竞争，可形成自身环化、线形二聚体和环化二聚体3种不同构型的DNA分子。
在一定浓度下，小分子 DNA片段进行分子内连接，有利于形成环化分子。对于长度一定的DNA分子，其浓度降低有利于分子环化。DNA浓度增加有利于分子间的连接，形成线性二聚体或多聚体分子。要使载体DNA与外源插入片段连接形成重组体，不仅要考虑反应体系中DNA末端的总浓度，而且还要考虑载体与插入片段末端浓度的比例。原则上，应该保证一个DNA分子的末端具有较高的概率与另一个DNA分子连接，减少同一个分子两个末端之间的自身连接，以达到重组的目的。
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